Molekyylibiologiset tutkimusmenetelmät ja niiden käyttö

Molekyylibiologiset tutkimusmenetelmät tärkeä rooli nykylääketieteen, rikosteknisen tutkimuksen ja biologia. Ansiosta kehitys tutkimuksessa DNA ja RNA, henkilö on mahdollisuus tutustua organismin genomiin määrittää aiheuttava aine, tunnistaa halutun nukleiinihapon happojen seosta, jne.

Molekyylibiologisten menetelmien avulla. Mikä se on?

Takaisin 70-80s tiedemiesten oli ensimmäinen tulkita ihmisen genomin. Tämä tapahtuma vauhdittivat kehitystä geenitekniikan ja molekyylibiologia. Tutkimus ominaisuuksia DNA: n ja RNA: n on merkinnyt sitä, että se on nyt mahdollista käyttää näitä nukleiinihappoja varten sairauden diagnoosin, tutkimuksen geeni.

DNA: n valmistus ja RNA

Molekyylibiologian diagnostisia menetelmiä edellyttävät lähtöaineena: usein tämä nukleiinihappo. On olemassa useita tapoja valita nämä aineet soluista elävien organismien. Jokaisella on omat etunsa ja haittansa, ja se on otettava huomioon valittaessa menetelmää nukleiinihappojen eristämiseksi puhtaassa muodossa.

1. DNA: n valmistus, jonka Marmur. Menetelmä koostuu hoidettaessa alkoholin seosta aineiden, saostuu tuloksena puhdas DNA. Haittapuoli tässä menetelmässä on syövyttävien aineiden, fenoli ja kloroformi.

2. DNA: n eristäminen puomin. Tärkein aine, jota käytetään tässä - on guanidiinitiosyanaattia (GuSCN). Se edistää kerrostumista deoksiribonukleiinihappo erikoistuneisiin substraatteja, josta se voidaan myöhemmin talteen erityisellä puskuria. Kuitenkin GuSCN - on inhibiittori TCP, ja jopa pieni osa, joka saa talletetaan DNA voi vaikuttaa aikana polymeraasiketjureaktio, mikä on tärkeää, kun työskennellään nukleiinihappojen kanssa.

3. Precipitation epäpuhtauksia. Menetelmä eroaa aikaisemmista, että molekyylit eivät itse talletettu dehoksiribonukleinovoy hapon ja epäpuhtauksien poistamiseksi. Tehdä tämän, käytä ioninvaihtimet. Haittapuolena on, etteivät kaikki aineet voivat laskeutua.

4. Mass seulonta. Tätä menetelmää käytetään silloin, kun ei tarvitse olla tarkkaa tietoa rakenteen DNA-molekyylin, ja tarve saada joitakin tilastoja. Syynä on se, että nukleiinihappo rakenne voi vahingoittua käsiteltäessä pesuaineita, erityisesti alkalit.

Luokittelu tutkimusmenetelmien

Kaikki molekyylibiologisten menetelmien tutkimus on jaettu kolmeen pääryhmään:

1. Monistus (käyttämällä useita entsyymejä). Tämä sisältää PCR - polymeraasiketjureaktio, joka on tärkeä rooli monissa diagnostisissa menetelmissä.

2. Neamplifikatsionnye. Tämä ryhmä menetelmien liittyy suoraan työhön nukleiinihapposeoksista. Esimerkkejä ovat 3 erilaista blotit, in situ -hybridisaatio, jne.

3. Menetelmät perustuu siihen havaintoon, että signaalin koetinmolekyylin, joka sitoutuu spesifiseen DNA: han tai RNA-koetin. Esimerkki - hybridisaatiosysteemiä Hybride Capture System liuos (LP2) varten.

Entsyymejä, joita voidaan käyttää molekyylibiologisia tutkimusmenetelmiä

Monet molekyylidiagnostisen tekniikoista liittyy laaja valikoima entsyymejä. Alla käytetään useimmiten:

1. restriktioentsyymillä - "leikata" DNA-molekyylin tarvittavat osat.

2. DNA-polymeraasi - syntetisoi kaksijuosteinen deoksiribonukeliinihappomolekyylin.

3. Käänteistranskriptaasivapautumiset (käänteistranskriptaasi) - käytetään syntetisoimaan DNA: RNA-templaatista.

4. DNA-ligaasi - vastaa muodostumista fosfodiesterisidokset nukleotidien.

5. eksonukleaasi - poistaa nukleotidia päätyosat deoksiribonukeliinihappomolekyylin.

PCR - perusmenetelmä DNA: n monistuksen

Polymeraasiketjureaktio (PCR) on käytetty laajalti modernin molekyylibiologian. Tämä menetelmä, jossa yksi DNA-molekyyli voidaan saada suuri määrä kopioita (vahvistamiseksi molekyyli).

Päätoiminnot PCR:

- sairauksien diagnosointiin;

- kloonaamalla DNA-segmenttejä, Gene.

Suorittaa polymeraasiketjureaktiolla vaatii seuraavat elementit: ensimmäinen DNA-molekyyli, lämpöstabiili DNA-polymeraasi (Taq- tai Pfu), deoksiribonukleotidi fosfaatit (typpi- emäksiä), alukkeet (2 aluke 1 DNA-molekyyli), ja itse puskurin, joka voi suorittaa kaikki reaktiot.

PCR koostuu kolmesta vaiheesta: denaturointi, alukkeen pariutumisen ja pidentymisen.

1. denaturointi. Lämpötilassa, joka on 94-95 astetta proshodit rikkoa välisten vetysidosten kahden ketjun DNA, ja sen seurauksena saadaan kaksi yksijuosteista molekyylejä.

2. hehkutettu alukkeita. Lämpötilassa, joka on 50-60 astetta tapahtuu liittyminen alukkeita päissä yksijuosteisten nukleiinihappomolekyylit mukaan tyypin täydentävät toisiaan.

3. Venymä. Lämpötilassa, joka on 72 astetta syntetisoidaan tytär kaksijuosteinen deoksiribonukleiinihappo molekyylejä.

DNA-sekvensointi

Molekyylibiologiset tutkimusmenetelmät vaativat usein tietoa nukleotidisekvenssin molekyylissä deoksiribonukleiinihappoa. Määrittää geneettisen koodin sekvensoitiin. Molekyylidiagnostiikka tulevaisuudessa perustuu hankitulle tiedolle määritettäessä ihmisen sekvenssin.

Seuraavantyyppiset sekvensointi:

• sekvensointi Maxam-Gilbert;
• Sangerin sekvensointia;
• pyrosekvensointi;
• nanoporovoe sekvensointi.